Romanens hjältinnor är sex flickor-skolflickor, förenade i "Brody-klanen" enligt deras älskade lärares, fröken Gene Brodys vilja. Handlingen äger rum i Edinburgh på trettiotalet. Fröken Brodie driver en liten flickors grundskola på en respektabel privatskola. Vid en av de första lektionerna i historien berättar fröken Brody istället för en föreläsning om den tragiska handlingen av hennes första kärlek - hennes fästman dog i kriget en vecka innan vapenvila - som berör flickorna till tårar. Så börjar hennes klasser i "Sanning, bra och skönhet" med de mest okonventionella metoderna. Genom att ge upp sig själv att uppfostra barn gav hon dem, i sitt eget favorituttryck, "frukterna av hennes storhetstid."
Fröken Brodie var i sin huvudsak, trots okonventionella metoder, inte alls en exceptionell händelse, eller inte helt i hennes sinne. Hennes unikhet bestod bara i det faktum att hon undervisade vid en sådan konservativ utbildningsinstitution. På trettiotalet, som fröken Brodie, fanns det legioner: kvinnor som var trettio år och äldre, som fyllde sitt oroliga krigförntida liv med kraftfull verksamhet inom områdena konst och social välfärd, upplysning och religion. Vissa var feminister och främjade de mest avancerade idéerna, andra var begränsade till deltagande i kvinnokommittéer och kyrkamöten. Men kvinnor i den första kategorin undervisade naturligtvis inte i konservativa skolor, där hade de inte någon plats. Det var vad fröken Brodies kollegor tyckte. Men fröken Brody, omgiven av sina utvalda elever, Brody-klanen, förblev otillgänglig för intriger. "Oskaklig, som en klippa", beundrar hennes beundrare när hon stolt går längs skolkorridoren till de hånliga hälsningar från hennes mer vanliga kollegor.
Fröken Brodie verkar extraordinär, åtminstone i skolan. Hon är inte vacker och inte alls ung, men vid "hennes främsta" upplever hon blixtar av äkta charm och i sådana stunder är hon ovanligt bra. Hon är också extremt attraktiv för män och erövrar hjärtan hos de två enda manliga lärarna i skolan.
Med Miss Brodys storhetstid sker de första stegen i en fantastisk spirituell evolution, som förändras internt och externt så snabbt som hennes växande elever. Medan flickorna fortfarande studerar under hennes övervakning i grundläggande betyg, förvandlar fröken Brody lektioner i matematik, engelska eller historia till märkliga utflykter inom alla områden i mänsklig kultur, från erotik till fascism: hennes passionerade konstnärliga natur, som inte känner till några religiösa förbud, dyrkar båda och under tiden Giotto och Mary Stuart.
Gradvis, omöjligt för sig själv, växer en riskabel tro på sin egen syndlöshet i henne; under sin storhetstid överskrider den gränserna för vilken etik som helst och når en verkligt chockerande grad av omoral.
Men hittills är dess inflytande på Brody-klanen obegränsad. Den består av sex flickor: Monica Douglas, känd för matematiska förmågor och vilda utbrott av ilska, atletiska Eunice Gardner, graciösa Jenny Grey, långsamma Mary McGregor, Sandy Stanger med ovanligt små grisögon och därefter berömd för sin sexappell Rose Stanley. De växer under Miss Brodys kraftfulla andliga inflytande, deras inre liv är helt fylld med en analys av deras lärares observationer. En dag under en utflykt förklarar fröken Brody för flickorna vad som faktiskt betyder att lära till henne. När hon utbildar barn framhäver hon de egenskaper som är naturliga i dem, men hon är också skyldig att investera i barninformation som är främmande för dem. Hon övertygar "klanen" att varje flicka måste växa upp och förverkliga "hennes kallelse" när hon hittade henne i dem.
Fröken Brodie är på väg till toppen av sin premiär; flickor växer upp och utvecklas med henne. Det verkar för henne att ingen bättre än henne gissar barnens riktiga kallelse, och gör häftiga ansträngningar för att instruera flickorna på det enda rätt sättet, det verkar henne.
Var och en av "Brody-klanen" lever ett individuellt och unikt öde, helt annorlunda än de kallelser som miss Brody har uppfattat. Hennes posthuma roll i deras vuxna liv är mycket subtilare och mer komplex.
Mer tragiskt än resten är Mary McGregor, en oväntad idiot för vänner och fröken Brody. Hon dör vid tjugotre på ett brinnande hotell och kort före sin död, i ett sorgligt ögonblick, bestämmer sig att de lyckligaste stunderna i hennes korta liv var de som hon tillbringade i sällskap med fröken Brody och hennes “klan”, om än på långsamma tänkande. Alla flickor på sitt eget sätt förråder Miss Brodys ideal. Strax innan de dör av cancer överlever deras mentor äntligen från skolan under påskott av att predika fascism för barn. Fröken Brodie beundrade faktiskt nästan naivt ordning och disciplin i fascismens länder tillsammans med monument och fontäner. Och nu uppmanar Sandy Stanger, hennes förtroende, redan på examensgränsen direktören, fröken Brodys främsta olycka, att hitta fel med politiska övertygelser och tvinga fröken Brody att avgå. Sandy går det svåraste och motsägelsefulla sättet. Förråd mot henne leder till förtroende för att Miss Brodys aktiviteter i slutändan skadar hennes favoriter. Faktum är att fröken Brody förälskas i en ritlärare, Teddy Lloyd, en stor katolik. Insåg att denna kärlek inte är möjlig, ingår hon, som för att trots sig själv, en relation med Gordon Loiter, en musiklärare. Men hon älskar Teddy, menar att en av flickorna borde ersätta henne och bli hans älskarinna. Hon sätter sitt hjärta och själ i denna vilda plan, enligt vilken Rose Stanley, flickans mest feminina, borde överge sig till konstnären istället. Men Rose är helt likgiltig mot Teddy, och Sandy blir hans älskarinna. Samtidigt var och förblir fröken Brody konstnärens sanna mus, och med förvåning ser Sandy att oavsett vilka av flickorna i ”klanen” Teddy-ritningar, Miss Brodys funktioner alltid dyker upp i henne. Sandy, som har psykologens kalla, analyserande sinne, kan inte förena sig med mysteriet om den ”roliga gamla pigaens” mystiska och kraftfulla inflytande på alla omkring. Det visar sig snart att en av fröken Brodies fans, som inte tillhör "klanen", släpper efter hennes agitation och flyr till Spanien för att kämpa på sidan av fascisten Franco. Hon dör längs vägen i tåget. Sedan, skräckt, ger Sandy fröken Brody regissören, och hon antyder på fröken Brody. Tanken på förråd undergräver Miss Brodys oändliga anda. Fram till sin död upphör hon aldrig att plåga sig själv och andra med karga spekulationer. I själva verket verkar det för Sandy att hela "klanen" förråder Miss Brody och avstår från "kallelserna". Fröken Brody såg i sina flickor ”instinkt och insikt” värda ett fullständigt och livfullt liv. Sandy, efter förråd, åker till klostret, där hon är olycklig och besviken. Rose Stanley blir en dydig hustru, även om hon har en ny Venus, "en stor älskare", enligt fröken Brody. Men de känner alla att de har lurat sig själva.
Under årens vänskap med fröken Brody är de så genomsyrade av hennes tro att de får en inre andlig likhet med henne, som konstnären Teddy Lloyd korrekt fångade i sina målningar.